TÉCNICAS FITOHISTOLOGICAS

INTRODUCCIÓN

Una preparación histológica es el corte fino de un tejido con el fin de ser observado al microscopio. Según las necesidades de estudios, las preparaciones pueden ser temporales o permanentes. Las primeras son frescas para la observación de células vivas, utilizando colorantes vitales (aquellos que causan poca alteración físico-química en el protoplasma de la célula) o en su caso células muertas utilizando colorantes supra vitales, este tipo de preparaciones se desecha el mismo día.

Las preparaciones permanentes son conservadas por largo tiempo, se obtienen de complejo procesos y su montaje se realiza con bálsamo de Canadá o resinas sintéticas. Cualquiera que sea la elección del observador por uno u otro tipo de preparación, debe tomar en cuenta que los métodos a emplear están en función de:

1. El carácter del material
2. El uso que se le dará a la preparación
3. Disponibilidad de equipo, sustancias químicas y tiempo.

Las preparaciones temporales son las  más sencillas de elaborar, estas se pueden realizar con material fresco de fácil manejo, por medio de cortes directos de tipo transversal, radial, tangencial o por medio de frotis o aplastado. Los pasos a seguir para su elaboración son los siguientes:

1. Corte: se hacen cortes finos, según la estructura deseada a observar, se colocan en cajas de Petri que contengan agua corriente, de donde se seleccionan los cortes  más finos y se colocan en un portaobjetos; o también pueden hacerse un raspado ligero de una estructura carnosa.
2. Tinción: se agregan de  una a tres gotas de colorante, a fin de que la estructura quede cubierta, se deja reposar de dos a tres minutos.
3. Enjuague: se coloca el cubreobjetos, se enjuaga el exceso del colorante con agua corriente en caso de cortes, no así para el raspado o frotis.
4. Observación: se seca con un lienzo o papel tanto la inferior del portaobjetos como los extremos no cubiertos por el portaobjetos, y se coloca en el microscopio para su observación.

Para elaborar las preparaciones permanentes se sigue un largo proceso de laboratorio que incluye las siguientes etapas:

1. Fijación: se selecciona el material biológico, realizando el corte de una porción representativa de menos de 1 cm y se incluye en F.A.A ( solución de ácido acético, alcohol del 96% y agua destilada, proporción 1:1:1 )
2.  Deshidratación: la porción de la planta se pasa por alcoholes de menor a mayor concentración, hasta llegar a alcohol absoluto. (alcohol al 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, y absoluto).
3.  Inclusión: deshidratado el material biológico se incluye en cera especial para histología.
4.  Corte: los cortes se realizan con micrótomo, logrando un grosor de entre cinco y nueve micras.
5. Tinción: para llevar a cabo la tinción se elimina la cera del tejido y se fija este a base de calor, posteriormente se tiñe con diversos colorantes en ocasiones la tinción puede durar de una a veinticuatro horas, según sea el colorante utilizado.
6. Contra tinción: en algunas técnicas de tinción se utiliza más de un colorante, y dependiendo de si este es a base de agua o de alcohol, se hidrata o se deshidrata el tejido, pasándolo por los alcoholes a las deferentes concentraciones como los ya mencionados.
7. Clarificación: los reactivos clarificantes tienen la misión de limpiar el material, eliminando algunos contenidos celulares. El reactivo clarificante por excelencia es el hipoclorito sódico. Se emplea concentrado o diluido en agua según sea el grosor del corte y la consistencia del material.
8. Impregnación-montaje: una vez terminado el proceso, se agrega sobre el tejido una gota de bálsamo de Canadá, que es una resina natural sobre la que se coloca el cubreobjetos, haciendo una ligera presión para que quede sellado, teniendo cuidado de que no quede espacios con aire: los excesos de la resina se eliminan con xilol, se limpian la preparación y se da por terminado el montaje.

Esta es la forma de obtener laminillas que pueden conservarse por años, de tejidos tanto duros como suaves o blandos, pero que tienen un proceso de tejidos muertos después de la fijación.  Este último tipo de preparación no las elaborara pero las usara continuamente, por lo que le recomendamos su uso y cuidado adecuados debido a su excesivo costo.

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USO DEL MICROSCOPIO

INTRODUCCIÓN

El microscopio es un instrumento indispensable en el laboratorio, ya que al observar a través de él alguna estructura, esta se verá aumentada en tamaño considerablemente, ayudándonos a distinguir detalles que a simple vista no se podrían observar.

Robert Hooke, científico Inglés, en 1665 fue el primero que, utilizando un microscopio, describió la estructura del corcho, semejante al panal de las abejas comparándolas con celdas, espacios que habían sido ocupados por células vivas, dando pauta al descubrimiento de la célula. Observo también otros tejidos vegetales. Posteriormente, en 1674, Antoni Van Leeuwenhoek, fabricante alemán de lentes, fue el primero en observar organismos unicelulares.

A paso de los años, los lentes se perfeccionaron a tal grado que el microscopio aumento su poder resolutivo. Esta mejora en los instrumentos utilizados en el examen de las células esta íntimamente ligada al adelanto registrado en las técnicas del microscopio, que lograron formar una imagen dotada de un contraste perceptible. Este hecho es la piedra angular de la biología.

La utilización del microscopio ha permitido conocer las diversas estructuras celulares de los seres vivos, ya que es un instrumento fundamental para la investigación en Medicina y Biología, entre otras ciencias.

En Botánica, el estudio celular y la estructura de tejidos, es considerado importante en el conocimiento general de especies vegetales y con base en sus estructuras, en el análisis de su función como componentes de un ecosistema.

La mayoría de los conocimientos actuales sobre la estructura celular se obtuvo con la ayuda de los microscopios ópticos, estereoscopio, de contraste de fases y electrónico; por mencionar algunos que permiten ampliar el campo de investigación sobre la estructura celular.

El microscopio estereoscopio o de disección es un instrumento que sustituyo a los lentes de mano, este permitió la manipulación con ambas manos. El uso de este instrumento ha sido recomendado como rutina en la disección de tejido vegetal.

El microscopio óptico realiza una función importante como tiene alta resolución, puede mostrar una imagen con detalles finos que el ojo humano no percibe a simple vista. Estos instrumentos son fabricados con precisión y con una alta calidad, y son capaces de dar magníficos resultados si son usados en forma adecuada.



Partes que constituyen a un microscopio:

• SISTEMA MECÁNICO
• SISTEMA ÓPTICO
• SISTEMA DE ILUMINACIÓN

Descripción de las partes que constituyen a un microscopio óptico.

1. SISTEMA MECÁNICO

• Soporte: Hecho de metal pesado, en forma de "Y" o de "u", sirve para dar firmeza y estabilidad al aparato.
• Columna: Une a la platina con la base y sostiene al condensador y al diafragma.
• Brazo de Potencia: Es una pieza vertical situada en la parte posterior del soporte.
  Por su parte inferior se articula en algunas ocasiones con una charnela que permite inclinar el microscopio.
• Tubo: Es un cilindro hueco de aproximadamente 160 mm de longitud obscurecido por dentro y por fuera. Proporcionando sostén a los oculares y objetivos.
• Revolver: Es un tabor giratorio que contiene un sistema de lentes rotatorios llamados objetivos.
• Cremallera: Sirve para subir o bajar el tubo, lo que implica acercar o alejar el objetivo del espécimen que va a observarse.
• Tornillo Macrometrico y Micrometrico: Se utiliza para enfocar la muestra objetivo de la observación.
• Platina: Lamina metálica, colocada horizontalmente, en la que se sostienen las preparaciones. Cuenta con una perforación central que permite el paso de la luz a travez de la muestra. La platina posee, ademas dos pinzas que sujetan la preparación con firmeza. La platina puede ser móvil verticalmente así como horizontalmente, esta movimiento se debe a una cremallera unida a la potencia.

2. SISTEMA ÓPTICO

• Ocular: Esta situado en la parte lateral del tubo, examina y amplia la imagen producida por el objetivo. Se compone de dos lentes. La primera, que es la inferior, recoge la imagen del objetivo, la reduce y la reforma. La segunda lente, que es la superior, forma una imagen virtual aumentada para ser vista.
• Objetivos: Son los que controlan el aumento posible y la calidad de la imagen. La mayoría de los microscopios tiene tres o cuatro objetivos dispuestos en el revolver que, al girar, dan cambios rápidamente ajustándolos al tubo.
• Potencia de Aumento: El aumento total del microscopio se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el ocular, a condición de que la longitud del tubo sea de 160 mm.

3. SISTEMA DE ILUMINACIÓN

• Condensador: El cono de la luz que ilumina la preparación procede del sistema condensador, montada debajo de la platina. El montaje esta dispuesto de modo que el condensador puede subir y bajar. El condensador es un sistema de lentes (de dos a cuatro) que maneja la iluminación concentrando la luz que procede de la lampara.
• Diafragma: Es una abertura en la parte inferior del condensador controlada por una palanca lateral, la cual regula la cantidad de luz que llega al objetivo.
• Lampara: La iluminación del microscopio puede ser suministrada por una lampara incorporada en la base.

Las partes de un microscopio pueden variar de acuerdo a la marca y fecha de construcción de los mismos.

Aumento y Poder de resolución del Microscopio

La posibilidad de estudiar objetos pequeños con el microscopio depende de su poder de amplificación y de su poder de resolución, pero principalmente de este ultimo.

La amplificación se obtiene mediante los dos sistemas de lentes ya descritos, el ocular y el objetivo. El objetivo enfoca los rayos de luz procedentes de la muestra, formando una imagen real aumentada dentro del tubo del microscopio. La imagen real se amplifica posteriormente por el ocular.  Así pues, la amplificación total del microscopio compuesto sera el producto del aumento del objetivo por el del ocular.  El numero de aumentos del objetivo y el ocular vienen grabados sobre la propia montura de los mismos.

Ej: El objetivo 20x con un ocular 10x dará un aumento de 200 diámetros.

Puesto que la amplificación total de un microscopio compuesto es el producto de la amplificación de dos sistemas de lentes, podría pensarse en aumentar indefinidamente la imagen usando lentes adicionales.  Desafortunada-mente, no existe forma de mejorar de esta manera el microscopio compuesto que conocemos en la actualidad.   El factor limitan-te radica en la naturaleza de la luz.  Tan importante como el poder de resolución de una lente es su capacidad de presentar como distintos y separados dos puntos adyacentes cercanos.  El poder resolutivo del ojo humano es de 0.1mm.   Esto quiere decir que a simple vista somos capaces de distinguir como independientes dos puntos separaos 0.1mm entre si, en tanto que si están mas próximos los veremos como un solo punto. 

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